Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF568-conjugated重組霍亂毒素B亞基（CF568標記，紅色熒光）

產(chǎn)品信息

背景描述

霍亂毒素（Cholera toxin，CTX）是霍亂弧菌產(chǎn)生的毒力因子，會引起嚴重腹瀉以及人體脫水。CTX屬于AB5亞基家族。天然六聚體蛋白含兩個亞基，分子量約85kDa。由一個A亞基（約27.2kDa）和五個B亞基（約11.6kDa/亞基）組成，B亞基以五聚體環(huán)的方式排列，呈明顯的五度對稱，負責毒素識別并吸附細胞表面的神jing節(jié)苷脂GM1。

A亞基催化刺激性G蛋白α亞基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亞基。Gαs的活化引起腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性增加，進而促使cAMP水平提高。A亞基還能ADP核糖基化視桿細胞外節(jié)膜盤的轉(zhuǎn)運蛋白，使得GTPase失活。霍亂毒素還是一種高效的黏膜疫苗佐劑，通過抑制IL-12生產(chǎn)來誘導2型輔助性T細胞的免疫應答。

霍亂毒素B亞基（CTB）對細胞無毒，本質(zhì)上不含腺苷酸環(huán)化酶活性。CTB通過結(jié)合神jing節(jié)苷脂GM1附著到細胞上，是小膠質(zhì)細胞的良好標記物（這類細胞表面富含神jing節(jié)苷脂GM1），但不適合標記少突膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞。

CTB是利用組化方法研究軸突運輸?shù)膬?yōu)秀示蹤劑。CTB也是常用的脂筏標記物，脂筏是富含膽gu醇和鞘脂的膜微區(qū)，在細胞信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)運輸中發(fā)揮重要作用。

產(chǎn)品描述

本品是偶聯(lián)上紅色熒光素-CF568（Ex/Em=562/583 nm）的重組霍亂毒素B亞基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF568-conjugated，簡寫：CF568 conjugated- rCTB，適用于神經(jīng)學研究中的束路追蹤，靶向神jing節(jié)苷脂GM1）結(jié)合和逆行運輸。也可在活細胞或固定細胞成像中用作脂筏標記物和內(nèi)吞示蹤劑。

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，至少6個月有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 本品以凍干粉形式提供，由于量比較少，初次使用前需置于室溫回溫至少30min，低速離心后，再開蓋直接往瓶內(nèi)加入合適的溶劑進行溶解。

2） CF系列熒光染料是Biotium的注冊商標，Alexa Fluor和DyLight系列染料是Thermo Fisher的注冊商標，Cy系列染料是Cytiva的注冊商標。

3） 本品僅供科研用途，絕不可以用于臨床或診療用途。

4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

以下是用熒光標記的rCTB對細胞進行標記的實驗流程。對于其他的應用（比如：神經(jīng)示蹤），請根據(jù)應用查找相應的文獻作為參考。

一、 自行準備材料

1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）（比如：MS3552-500ML）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：MP6101-5G）

1.3 HBSS（比如：MS3505-500ML）

1.4 4%多聚甲醛（比如：MM1504-500ML）

1.5 【可選】Hoehcst 33342（比如：MX4203-10MG，MX4203-1ML，MX4204-10ML）

二、 染料準備

重溶：將低溫保存的CF568 conjugated- rCTB（規(guī)格：100μg）置于室溫回溫至少30min，低速離心3-5min，將粉末離心至管底。直接往瓶子加入100μl無菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鮮制備的CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3個月穩(wěn)定。亦可根據(jù)單次用量分裝后，置于-20℃避光保存，6個月穩(wěn)定，避免反復凍融。

三、 活細胞的表面標記

3.1用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞一次；

3.2用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA稀釋CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作濃度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走細胞內(nèi)的緩沖液，加入新鮮配置的CF568 conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞三次；

3.5用4%多聚甲醛固定細胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗細胞二次，之后進行成像或接著做后續(xù)的染色。【注：根據(jù)實驗需求，考慮是否加入核復染劑-Hoechst 33342等】

應用實例（來自文獻，僅做參考）

Ref1）Uddin O, Anderson M, Smith J, Masri R, Keller A. Parabrachial complex processes dura inputs through a direct trigeminal ganglion-to-parabrachial connection. Neurobiol Pain. 2021 Jan 21;9:100060. doi: 10.1016/j.ynpai.2021.100060. PMID: 33537510; PMCID: PMC7840999.

實驗目的：解剖追蹤（Anatomical tracing）

實驗方法：We used a glass pipette with a 40 µm tip to pressure inject (Nanoliter 2010 pump, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 500 nL (50 nl/min) of CF568-conjugated cholera toxin B (CF568 conjugated CTB;) into PB unilaterally (right side). We made a craniotomy over the right middle meningeal artery and carefully exposed the dura, applying 5 µl of Fluorogold (Hydroxystilbamine) to the area, diluted to 5% in sterile saline, using a sterile pipette tip. We covered the dura application site with sterile Gelfoam and closed the incision with nylon suture. One week after tracer application we deeply anesthetized the rat with urethane and performed a transcardial perfusion with 0.05M PBS followed by 4% PFA.

實驗圖片：

Fig.Dura afferents project directly to PB. (A) A map of the injection site cores, depicted by black outlines. (B) The diagram depicts the experimental setup. CTB labels PB-projecting TG neurons and Fluorogold labels dura-innervating TG neurons. (C) Examples of dual-labeled neurons are representative images from 3 different animals–arrows denote double labeled cells. The green arrows indicate Fluorogold labeling and the red arrows indicate CTB labeling. Confocal images are shown in their native grayscale format.

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附錄I幾款CF染料的光譜特征

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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